浏览数量： 0 作者： 迪飞医学 发布时间： 2022-12-14 来源： 迪飞医学
/ 导读 /
2022年7月，上海交通大学医学院附属第一人民医院张旻教授团队与华盛顿大学、福州肺科医院专家在Frontiers in Cellular and Infection Microbiology（IF=6.073）杂志发表了一篇前瞻性研究，通过群体感应(QS)系统评估、全基因组测序（WGS）、进化实验等方法，评估非囊性纤维化支气管扩张（NCFB）患者在慢性铜绿假单胞菌肺部感染过程中是否会产生lasR突变的耐药选择并阐述其机制。迪飞医学作为共同作者参与了该研究的数据分析。
/ 研究背景 /
铜绿假单胞菌是一种常见的机会致病菌，可引起非囊性纤维化支气管扩张(NCFB)患者的慢性感染并释放多种毒力因子，导致发病率升高、生活质量下降和治疗负担增加。因铜绿假单胞菌对抗生素的显著耐药性，要根除它已经变得越来越困难。
多重耐药（MDR）的发展可以影响铜绿假单胞菌分离株的进化和适应，并促进其成为慢性感染患者的频繁定植者。在这个过程中，细菌的某些生理系统功能可能会发生改变，群体感应(QS)就是其中之一。铜绿假单胞菌利用QS系统，以依赖细胞密度的方式调节数百个基因的表达，其中许多基因编码分泌毒力因子，如蛋白酶、弹性蛋白酶、氰化氢和吩嗪，这使得QS系统组分成为抗毒治疗的潜在靶点。QS系统由许多小信号分子介导，包括N -3-氧-十二烷基高丝氨酸内酯(3OC12-HSL)和N-丁醇-高丝氨酸内酯(C4-HSL)，这两个关键信号分层激活LasR-LasI系统和RhlR-RhlI系统。3OC12-HSL是LasI合酶的产物，当其环境浓度增加到阈值时，可与转录激活剂LasR结合，激活一系列基因，包括编码C4-HSL信号合酶的rhlI和编码C4-HSL受体的rhlR。
慢性肺部感染患者中分离的铜绿假单胞菌常缺乏QS，但lasR突变型菌株是最常见的，有报道其频率超过30%。这一现象背后的机制仍然不为人所知。可能有一个强大的选择压力，使lasR突变体可能在一定的生长条件下具有生理优势。此外lasR突变体的出现也得益于QS野生型菌株产生的胞外产物。既往研究报道，lasR突变体是在需要QS条件下的长期培养过程中从野生型祖先进化而来的，与野生型亲本共培养时具有选择优势。以往研究表明，铜绿假单胞菌MDR的出现和QS功能之间存在相互作用。一方面，QS通过调控多药外排泵基因的表达，促进MDR的发生；另一方面，QS系统本身也受到多药外排泵表达的影响。目前外排泵对QS的影响是否会在临床铜绿假单胞菌菌株中形成对LasR活性的选择压力尚不清楚。
本研究收集了NCFB患者呼吸道分离的铜绿假单胞菌，比较了MDR和非MDR菌株的QS表型。通过全基因组测序(WGS)和进化实验，研究MDR机制对lasR突变体进化的影响。
/ 研究内容 /
研究前瞻性纳入为期2年的双中心慢性铜绿假单胞菌肺部感染成人患者，入组标准为确诊为NCFB且下呼吸道样本铜绿假单胞菌培养重复阳性的患者，铜绿假单胞菌感染持续14天以上。排除了与其他检测到的病原体共定植的患者。MDR铜绿假单胞菌定义为对三种或三种以上抗假单胞菌类药物(如碳青霉烯类、氟喹诺酮类、青霉素类/头孢菌素类和氨基糖苷类药物)的获得性不敏感。
患者临床特征
共97例铜绿假单胞菌慢性肺部感染患者纳入分析，其中非MDR定植63株，MDR定植34株。单因素分析发现，与非MDR相比，MDR患者感染持续时间明显更长，先前接触碳青霉烯类的频率也更高。进一步的多变量分析显示，只有先前碳青霉烯类暴露可以独立预测MDR铜绿假单胞菌株的分离(OR: 24.9, 95% CI: 5.2-156.0, p <0.0001)。
MDR分离株缺乏QS表型
每例患者选择一个分离株确定是否为MDR，比较MDR和非MDR菌株之间的QS表型，包括信号分子（3OC12-HSL 和 C4-HSL），毒力因子（绿脓菌素和蛋白酶）。结果发现，与非MDR分离株相比，MDR分离株中QS控制的信号分子和毒力因子的产量明显降低。且这些表型在MDR分离株中比在非MDR分离株中表现出更多的异质性。总体而言，在所有样本中，MDR分离株的QS表型均较非MDR分离株差，支持慢性肺部感染过程中出现QS缺陷与铜绿假单胞菌的MDR发生相关。此外通过测量MDR分离株在有或没有3OC12-HSL的情况下生长18 h后的QS控制毒力产量发现，降低的毒力产量不能通过外源性添加3OC12-HSL得到显著补充，表明MDR分离株的QS表型缺乏与LasR的功能障碍有关，而不是LasI。
为了确定QS缺陷表型的出现与MDR特征之间是否存在进化关系，研究分析了来自不同患者的11对分离株, 7例分离株从非MDR转向MDR，而其他4例分离株保持非MDR。发现在MDR转移患者的分离株中，复发分离株的QS表型明显较初始分离株差；但在维持非MDR的患者中，复发株和初始株之间的QS表型没有显著差异。表明QS缺陷表型发生在铜绿假单胞菌株MDR发生之后。
WGS确定MDR决定因素和QS基因突变
为阐明研究人群中MDR分离株的QS缺陷表型机制，研究筛选了30个体外生长速度与实验室菌株PAO1相似的菌株进行WGS。这些分离株包括来自不同患者的24株分离株和来自同一患者的3对分离株。采用单核苷酸变异分析来确定测序分离株之间的遗传亲缘程度。分析结果显示，这些分离株之间的遗传多样性很高，哪怕是来自同一患者的成对分离株也具有差异性。
耐药决定因素突变结果显示，未发现含有碳青霉烯酶基因的分离株；14个(93.3%)MDR分离株和11个(73.3%)非MDR分离株含有oprD的非同义突变，可能导致功能性oprD表达的丧失。比较MDR分离株与非MDR分离株的oprD非同义突变频率，两组间并无显著差异。其他耐药决定因素如ampC、ampR、ampD和dacB中虽然也存在非同义突变，但几乎都是错义突变，并无移码突变或者过早终止子突变，提示这些基因突变在分离株的耐多药发展中并没有发挥主要作用。
28株分离株(14MDR分离株和14株非MDR分离株)在lasR-I和rhlR-I系统中存在非同义突变，与实验室菌株PAO1不同。rhlI是最常见的QS系统突变基因，其非同义突变存在于26个分离株中。但其突变频率在MDR分离株和非MDR分离株之间无显著差异。lasI 和 rhlR基因突变只存在于2个分离株中，很少见。8株分离株存在lasR非同义突变，且几乎全部属于MDR组，只有一个来自非MDR分离株。这些数据表明在lasR-I和rhlR-I系统中，lasR基因的非同义突变频率在MDR分离株中显著高于非MDR分离株。
比较MDR和非MDR的QS基因(lasR和RhlI)和外排泵调节基因(mexR、nalC、nalD、mexZ和nfxB)的同义和非同义突变频率，并分析这些频率之间的相关性发现，同义突变频率在两组间无显著差异，但MDR分离株lasR、nalC和mexZ基因的非同义突变频率显著高于非MDR分离株。相关性分析结果表明，对于同义突变频率，lasR与外排泵调节基因（mexR, nalC和mexZ）的呈显著正相关，对于非同义突变，lasR仅与nalC和mexZ相关。计算这些基因的Ka/Ks比值以估计它们所经历的选择压力，结果发现MDR分离株中lasR、nalC和mexZ的Ka/Ks比显著高于非MDR分离株。lasR的Ka/Ks比值与nalC和mexZ的Ka/Ks比值有显著正相关性，支持MDR菌株中这些基因突变存在选择压力。
外排泵诱导的QS功能障碍的表型评估与进化实验
使用外排泵抑制剂PAbN评价外排泵活性及其对QS活性的影响。是否添加PAbN对生长曲线基本无影响。非MDR分离株的QS表型在添加和不添加PAbN的培养基中无显著差异。MDR分离株添加PAbN后，环丙沙星、头孢他啶和美罗培南的MIC下降超过50％；同时其QS信号和绿脓菌素显著增加。这些数据支持外排泵活性参与了这些菌株的MDR发展，导致QS信号分子和毒力因子产量低。
为了确定外排泵素对lasR突变的选择压力，分别对三个拥有完整lasR序列的QS-外排泵调节突变体（分离株17、20和24）进行了三个独立的进化实验。在九个实验中，有七个在不同的时间出现了lasR突变体。为了证实群体表型归因于外排泵活性的上调，我们通过添加外排泵抑制剂PAbN重复实验。QS菌株和QS缺乏菌株之间都保持了稳定的平衡，并使MDR菌株的表型与野生型PAO1相似。
/ 总结 /
1、这项研究是为了验证一个假设，即MDR的发展会对在NCFB患者定植的铜绿假单胞菌的lasR突变施加选择性压力。
2、临床MDR分离株呈现QS缺陷表型，包括低产量的QS信号分子和QS控制的毒力因子。外源添加信号3OC12-HSL不能改善这些表型。
3、不同时间获得的配对临床分离株显示其QS表型缺陷发生在MDR之后。WGS分析显示，临床MDR铜绿假单胞菌分离株外排泵活性上调，且lasR与外排泵调节基因nalC和mexZ的突变频率呈正相关。
4、进化实验表明，外排泵活性的上调促进了MDR分离株出现lasR突变。
5、综上提示，慢性肺部感染时，MDR铜绿假单胞菌上调的外排泵活性易发生lasR突变。抗QS联合外排泵抑制剂可能是MDR铜绿假单胞菌感染的NCFB患者的一种潜在治疗策略。
6、不足之处：只纳入了两个中心的人群，这可能会限制研究结果对其他中心患者人群的推广。另外不能排除其他机制参与MDR分离株中lasR突变体进化的可能性，需要更多的研究来澄清。
原文链接：
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcimb.2022.934439/full
Ding F, Han L, Xue Y, Yang IT, Fan X, Tang R, Zhang C, Zhu M, Tian X, Shao P and Zhang M (2022) Multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa is predisposed to lasR mutation through up-regulated activity of efflux pumps in non-cystic fibrosis bronchiectasis patients. Front. Cell. Infect. Microbiol. 12:934439. doi: 10.3389/fcimb.2022.934439
作者：山奈 吃吃个梨 审核：Zen-Master 排版：Moro
